MEDICINSKA FAKULTETA

UNIVERZA V LJUBLJANI

OSNOVE PREISKOVALNIH METOD
Molekularno genetske metode za diagnostiko v medicini

VAJA 7 in
VAJA 8

asist. dr. Rok Košir

Center za funkcijsko genomiko in biočipe

Inštitut za biokemijo

Medicinska fakulteta

Univerza v Ljubljani

LJUBLJANA, 2014

Komercializacija in etični vidiki genetskega testiranja

1. Uvod.

Genetski testi, ki so bili včasih dostopni le peščici elitnih raziskovalnih inštitucij so danes dostopni skoraj vsakemu posamezniku, ki ima dostop do spleta in je pripravljen plačati nekaj sto evrov. Tovrstni način prodaje genetskih testov neposredno končnim uporabnikom imenujemo – Direct to Consumer genetic testing (DTC-GT). Čeprav se število podjetij, ki tovrstna testiranja ponujajo, v zadnjih letih nenehno povečuje, pa se povečujejo tudi pomisleki in skrbi zdravnikov ter strokovnjakov s takšnim načinom prodaje genetskih testov.

Raziskave in znanje, ki je omogočilo razvoj DTC testov, v veliki meri izhaja iz prve objave osnutka človeškega genoma junija 2001. Po tej objavi so znanstveniki napovedali, da bo možno odkriti gene, ki so povezani s številnimi boleznimi in posledično izdelati teste za diagnozo in zdravljenje, če ne celo preprečevanje bolezni. Genska terapija naj bi tako postala vsakodnevna praksa. Čeprav so se napovedi o odkritju novih genov povezanih z določenimi boleznimi uresničile pa se časovna skala pri razvoju novih terapij in zdravil ni skladala s pričakovanji. Le pri določenih boleznih je odkritje genov vodilo tudi v razvoj uporabnih molekularno genetskih testov za preprečevanje ali upravljanje bolezni.

Pomemben dejavnik, ki je poleg omenjenega omogočil razvoj DTC testov, je bil in še vedno je nenehen razvoj novih metod določevanja nukleotidnega zaporedja DNA, ki so tekom zadnjega desetletja postajale vse zmogljivejše, hitrejše in cenejše. Lep primer predstavlja dejstvo, da bi za določitev genoma enega osebka v letu 2001 porabili okoli 10 milijard ameriških dolarjev, medtem ko se je ta cena danes približala nekaj več kot 5.000 dolarjev (2000-krat manj) (Slika 1).

Slika 1: Cena določanja nukleotidnega zaporedja DNA med leti 2001 in 2013.

DTC genetska testiranja s sabo prinašajo raznolika praktična in etična vprašanja, ki jih je potrebno podrobno obravnavati v vsaki državi posebej kot na nivoju celotne Evropske unije. Kljub temu, da so se v določenih državah problemi že podrobneje obravnavali, pa še vedno ne obstajajo potrebni predpisi in zakonodaja. Iz obeh razlogov obstajajo med članicami Evropske unije ogromne razlike pri urejanju genetskih storitev.

2. Genetsko testiranje v širšem pomenu besede.

Klinična genetika je v sklopu zdravstvenega sistema prisotna že vrsto let in je v vseh državah EU dobro razvita. V sklopu klinične genetike so se genetske raziskave osredotočale predvsem na določevanje kromosomskih aberacij ali določevanje genetskih mutacij pri redkih monogenskih dednih boleznih, malokdaj pa so bile analizirane kompleksne, poligenske bolezni.

Monogenske in poligenske (kompleksne) bolezni

Monogenske bolezni so posledica spremembe v enem samem genu. Ponavadi so to težke in redke bolezni, ki prizadanejo le majhno število ljudi. Narava bolezni je odvisna od tega, katere funkcije so zaradi mutiranega gena motene, vendar pomeni okvara v genu skoraj 100% verjetnost pojava bolezni (Huntingtonova bolezen) ali pa veliko povečanje tveganja razvoja bolezni (BRCA1 in BRCA2). Nekatere monogenske bolezni so posledica spremembe v enem samem alelu (Huntingtonovi bolezni), medtem ko se druge pojavijo šele, kadar sta spremenjena oba alela (cistična fibroza). Genetski testi za tovrstne bolezni se večinoma opravljajo v sklopu klinik.

Kompleksne genetske bolezni so posledica interakcije večih genetskih sprememb hkrati v kombinaciji z vplivi okolja in življenjskega sloga posameznika. Med kompleksne genetske bolezni uvrščamo sladkorno bolezen, večino rakavih obolenj, astmo in bolezni srca. Za razliko od monogenskih bolezni je pri kompleksnih genetskih boleznih udeleženo večje število genov, ki vplivajo na začetek, pojav in napredovanje bolezni.

Glede na namen genetskega testiranja poznamo različne tipe genetskih testov:

· Diagnostični genetski testi

Diagnostični genetski testi so namenjeni potrditvi diagnoze za določeno genetsko bolezen pri posamezniku, ki že ima znake bolezni. Rezultati testov lahko pripomorejo k odločanju o izboru ustrezne terapije in spremljanja bolezni. Prav tako lahko pripomorejo k postavitvi ustrezne diagnoze in tako posamezniku omogočijo, da se preneha iskanje vzroka za njegove težave ter tako končno potrdi za katero bolezen gre.

· Prediktivni genetski testi

Prediktivni ali napovedni genetski testi se izvajajo pri posamezniku, ki še nima zdravstvenih težav, povezanih z boleznijo. Namenjeni so odkrivanju genetskih sprememb, ki lahko pomenijo tveganje za pojav bolezni kasneje v življenju. Specifično tveganje se lahko med testi precej razlikuje. V redkih primerih tak genetski test z veliko zanesljivostjo napove tveganje za razvoj bolezni kasneje v življenju (tako je na primer pri testu za Huntingtonovo bolezen). V večini primerov pa prediktivni test napove samo okvirno tveganje za pojav bolezni v življenju posameznika, in ne poda natančne napovedi za pojav bolezni, saj poleg genetike pomembno vlogo igrajo tudi dejavnikj okolja. Takim prediktivnim testom pravimo tudi genetski testi dovzetnosti za določene bolezni.

· Testi prenašalstva

Testi prenašalstva se izvajajo v namen odkrivanja posameznikov, ki nosijo en mutiran alel določenega gena, povezanega s specifično boleznijo (npr. cistično fibrozo). Prenašalci nimajo nobenih znakov bolezni, obstaja pa tveganje, da se bo bolezen pojavila pri njihovih otrocih.

· Farmakogenomski testi

Farmakogenomski testi se izvajajo z namenom testiranja posameznikovega odziva na specifično terapijo. Nekateri posamezniki, na primer, potrebujejo višje doze zdravil za učinkovito delovanje, pri drugih posameznikih se lahko pojavijo pomembni stranski učinki na določeno zdravilo.

Glede na zgornjo razvrščanje spada večina DTC genetskih testiranj med napovedne (prediktivne) genetske teste ter  v manjši meri farmakogenomske teste.

3. Katere raziskave so pripomogle k pojavu in razvoju DTC genetskih testov?

K pojavu in razvoju DTC genetskih testov so poleg razvozlanja zaporedja človeškega genoma ter razvoja primerih tehnologij, bistveno pripomogle tudi raziskave človeške genetske variabilnosti ter genomske asociacijske raziskave (Genome Wide Association Studies – GWAS). Po objavi človeškega genoma je postalo jasno, da se ljudje v svojem genomskem zapisu med sabo razlikujemo na več milijonih mest, ki so jih poimenovanih SNPji (Single Nucleotide Polymorphisms). Hkrati pa se je pojavilo vprašanje: »Če se ljudje med samo razlikujemo na toliko mestih, ali obstajajo SNPji, ki so bolj pogosti v skupinah ljudi z določeno boleznijo, kot pri zdravih ljudeh?«. Na to vprašanje skušajo odgovoriti GWAS študije, ki analizirajo genome več sto ali tisoč zdravih ljudi ter ljudi z določeno boleznijo (npr. rak dojke) (Slika 2).

Slika 2: Zasnova GWAS študije. Dvema skupinama ljudi (zdravi in bolniki) izoliramo DNA ter v njej določimo prisotnost določenega števila enakomerno porazdeljenih SNP po genomu. SNPji, ki se v skupini bolnikov s statistično značilno razliko pojavijo večkrat, se označijo kot markerji za določeno bolezen.  

Primerjava prisotnosti SNPjev med zdravimi ljudmi in bolniki pokaže ali so nekateri SNPji statistično značilno večkrat prisotni pri bolnikih z določeno boleznijo. Če so, potem ta SNP in genomsko regijo kjer leži, povežemo oz asociiramo z določeno boleznijo. Pri klasičnih GWAS študijah se preverja prisotnost več 100.000 SNPjev in je rezultat pri večini študij statistično značilen le zelo majhno število SNPjev (ena do deset). Hkrati pa je pomembno poudarit določene omejitve GWAS študij:

· GWAS študije preverjajo prisotnost samo majhnega števila vseh SNPjev, ki so prisotni v genomu človeka in sicer tako imenovanih pogostih SNPjev. (Redkih mutacij te študije ne preverjajo).

· SNPji z nepoznano funkcija. Večina SNPjev, ki jih odkrijejo GWAS študije so SNPji v nekodirajočih zaporednih DNA ali celo ležijo daleč od kateregakoli poznanega gena.

· Statistična moč GWAS študij je omejena s številom pacientov in zdravih ljudi, katero mora biti čim večje (> 1000).

· Ponovljivost: podobne GWAS študije, ki so bile opravljene na zdravih ljudeh in pacientih z isto boleznijo med različnimi raziskovalnimi skupinami in med različnimi populacijami le redko pokažejo na iste SNPje, ki so udeleženi pri določeni bolezni.

4. Kako delujejo DTC testi?

Kot že omenjeno spadajo DTC testi, glede na različne oblike genetskih testov, med prediktivne oz. napovedne teste, pri čemer pa se podjetja osredotočajo v večji meri na kompleksne, poligenske bolezni oz najrazličnejše poligenske lastnosti (Tabela 1).

Tabela 1: Nekaj primerov bolezni in lastnosti na katere testirajo DTC testi:

Podvrženost razvoje bolezni	Lastnost	Odziv na zdravila
Astma	Tip krvne skupine	Metabolizem alkohola
Različne oblike rakov	Alkoholna odvisnost	Odziv na antidepresive
Diabetes	Atletska podvrženost	Metabolizem kofeina
Endometrioza	Teža pri rojstvu	Klopidogrel
Glavkoma	Barva oči	Fluorouracil
Srčni napad	Tip ušesnega masla	Odvisnost od heroina
Kardiovaskularna obolenja	HDL nivo holesterola	Odziv na zdravljenje hepatitis C
Neplodnost	Barva lasi	Tamoxifen
Osteoporoza	Dolgoživost	Varfarin

Podjetja DTC teste oglašujejo preko različnih medijev, ki vključujejo internetno prodajo, prodajo preko telefona in TV oglasov kakor tudi preko pošte. V večini primerov se prodaja vrši direktno do končnih uporabnikov, le v redkih primerih podjetja delujejo preko zdravnikov oz. zdravstvenega osebja. Končne kupce v želijo pritegniti z različnimi obljubami, ki jih bodo izpolnilo genetsko testiranje kot npr:

Primer iz spletne strani ponudnika DTC iz ZDA:

Order a kit from our online store. Register your kit, spit into the tube,

and send it to the lab. Our certifi ed lab analyzes your DNA in 2-3 weeks.

Log in and start exploring your genome.

Primer DTC iz Slovenije:

Celovita genetska analiza vam pove

dovzetnost za najpogostejše bolezni

in poda preventivne nasvete.

Po naročilu DTC testa, se kupcu po pošti pošlje zbiralnik sline, v katerega uporabnik odda majhen vzorec ter ga pošlje nazaj v podjetje v analizo. Iz sline oziroma brisa ustne sluznice se izolira DNA ter določi prisotnost različnega števila mutacij oz. SNPjev v genomu. Število SNPjev je odvisno od ponudnika in od števila bolezni, ki jih ponudnik v svojem testiranju preverja. Po končani analizi se s pomočjo računalniškega algoritma izračuna verjetnost razvoja določene bolezni oz. lastnosti ter pripravi PDF ali interaktivno on-line poročilo, ki ga kupec prejme na e-poštni naslov. Primer postopka opravljanja testa je prikazan na sliki 2 za podjetje 23andMe.

Figure 2: Postopek naročila DTC genetskega testiranja, primer 23andMe (ZDA).

5. Problemi DTC testiranj?

Rezultat napovedi verjetnosti obolenja za določeno boleznijo se pri DTC testih izračuna na podlagi prisotnosti določenih SNPjev v DNA. SNPji, ki se za teste uporabljajo so bili izbrani s pomočjo prej opisanih GWAS študij, ki pa imajo že kot same določene omejitve. Iz teh omejitev, načina prodaje ter načina izračunavanja verjetnosti razvoja bolezni izhajajo glavni problemi in pomisleki glede uporabe DTC testiranj.

Ali je % verjetnosti razvoja določeni bolezni dejansko točen in ali ima klinično uporabo?

Opravljenih je bilo že veliko raziskav tako v tujini kot tudi v Sloveniji, kjer je ista oseba, svojo DNA poslala različnim ponudnikom DTC testiranj, in nazaj dobila precej različne oz. celo nasprotujoče si rezultate. V večini primerov se % razvoja bolezni razlikuje med podjetju, ponekod celo do te mere, da eno podjetje trdi, da ima oseba visoko verjetnost razvoja bolezni, drugo pa da ima minimalno verjetnost. Vzrok tega je preprost. Različna podjetja uporabljajo rezultate različnih GWAS študij, ki se tudi za enako bolezen med sabo v večini primerov razlikujejo. Uporabljajo rezlično št. SNPjev za določeno bolezen kakor tudi različen postopek izračuna verjetnosti obolenja. Iz tega izhaja seveda tudi dejstvo, da tovrstni rezultati nimajo nobene klinične uporabe.

Ali je res vse v genih?

V večini DTC podjetjih od posameznika poberejo le slino iz katere izolirajo DNA in tako celotna analiza temelji zgolj na prisotnosti SNPjev. Dejstvo je, da je vloga in pomen teh SNPjev pri razvoju poligenskih bolezni precej majhna. 1.) Za večino uporabljenih SNPje ni znano kaj je njihova funkcija in kako njihova prisotnost vpliva za razvoj določene bolezni. 2.) Tudi če pri napovedi vključimo več SNPjev (kar večina DTC podjetij dela) ti za veliko večino

Slika 3: Zanesljivost rezultatov DTC podjetij: Ista oseba svojo DNA pošlje trem različnim DTC podjetjem. Rezultati za isto bolezen se med podjetji ne skladajo.

bolezni ne dajo boljše ocene rizika kot klasični klinični podatki. 3.) Pri razvoju poligenskih bolezni genetika ni vse. Izredno pomembno je tudi okolje v katerem posameznik živi, ki vključuje življenjski stil, prehrano, gibanje, itd.

Ali lahko zaupamo rezultatom DTC genetskih podjetij? Za večino DTC podjetjih je težko ugotoviti kam pošiljajo vzorce za analizo. Čeprav jih večina svoje spletne strani okrasi z lepimi slikami laboratorijev je dejstvo, da le majhna peščica teh podjetij analize opravlja sama. Predvsem pri podjetjih, ki analizirajo veliko število SNPjev naenkrat, se pojavi vprašanje o zanesljivosti določanja prisotnosti SNPja. Ali taka podjetja uporabljajo pozitivne in negativne kontrole, kakšna je klinična specifičnost in senzitivnost. Pojavi se tudi vprašanje ali so SNPji, ki jih podjetje uporablja v analizi bili izbrani iz kvalitetne GWAS študije, ki je bila opravljena za zadostnem številu osebkov, da je rezultat zaupanja vreden.

Ali se upoštevajo razlike med populacijami? SNPji se med populacijami na različnih predelih Zemlje močno razlikujejo, kar pomeni, da je lahko prisotnost določenega SNPja v eni populaciji povezana z razvojem določene boleznijo, med tem ko v drugi populaciji temu ni tako. Ali DTC podjetja to upoštevajo pri svoji analizi?

6. Etični vidiki DTC testiranj?

Glede na zgoraj omenjene težave in omejitve so se v povezavi z uporabo DTC genetskih testov pojavila številna vprašanja in kritike. DTC podjetja svojo storitev v največji meri zagovarjajo z izjavo, da ima vsaj posameznik pravico poznati svojo genetsko osnovo. To je sicer upravičena trditev, vendar se je v primeru DTC testiranj potrebno vprašati, ne če želimo vedeti ampak če lahko takšnemu testu in rezultatom zaupamo. Spodaj je na kratko opisanih nekaj etičnih pomislekov glede DTC testiranj:

1.) Genetsko svetovanje: Genetsko svetovanje je definirano kot proces v katerem ljudem pomagamo razumeti ter se prilagoditi vsem zdravstvenim, psihološkim in družinskim zapletom, ki jih lahko povzroči določena genetska bolezen. Čeprav veliko DTC podjetij genetsko svetovanje obljublja in ponuja, tudi preko interneta ali telefona in je vključeno v ceno, se uporabniki tega ne zavedajo. Pri določenih podjetjih pa je potrebno genetsko svetovanje doplačati, tudi do cene 250$ / uro. Genetsko svetovanje pa je v večini primerov izredno pomembno ne samo po opravljanem testu, ampak tudi pred njih, saj lahko le tako uporabnikom obrazložimo, prednosti, slabosti ter vrednost določenega genetskega testiranja. Nobeno DTC podjetje na primer ne nudi svetovanja pred nakupom testa.

2.) Vse bolezni na enem kupu: Večina strokovnjakov meni, da je očiten problem, da se v DTC teste zapakira cela vrsta popolnoma nepovezanih bolezni ali lastnosti. Npr. ali boste imeli skodrane lase, ali plešo podajajo skupaj z življenjsko ogrožajočimi boleznimi kot so rak ali Alzheimerjeva bolezen. Seveda se v primeru resnih obolenj ponovno pojavi vprašanje klinične uporabnosti teh testov, kar je bilo omenjen že zgoraj. DTC podjetja v večini primerov podajajo prevelik poudarek na pomen genetike.

3.) Psihološki dejavnik: Rezultati so velikokrat v obliki stolpcev, ki so obarvanih rdeče če je vaš % nas določeno vrednostjo. Kako to psihološko vpliva na osebo, če gre tukaj za npr. obolenje za rakom dojk? Zaradi odsotnosti genetskega svetovanja oz. podaje rezultatov takšnih testov s strani ustrezno izobraženega kadra, je velika verjetnost napačne interpretacije rezultatov.

4.) Od koga je DNA, ki se testira? Glede na to, da se celotna storitev pri večini podjetij opravi preko računalnika in pošte, obstaja velika verjetnost, da DNA, ki jo podjetje prejme in analizira ni DNA od pošiljatelja? Tako lahko DNA testiranja opravimo tudi na mladoletnikih oz drugih osebah brez njihovega vedenja in dovoljenja.

5.) Kaj se zgodi z našo DNA? Določen podjetja zagotavljajo uničenje sline in DNA po opravljenem testu, medtem ko pri drugih vašo DNA shranijo za nadaljnje raziskave. Kaj se s to DNA zgodi ko podjetje propade ali gre v stečaj ni jasno in tudi ni nobenih zakonov, ki bi določali kaj mora podjetje s tem narediti. Dejstvo je, da je zbirka takšnih podatkov izjemno dragocena.

7. Literatura:

· Direct-to-Consumer Genetic Testing: Summary of a Workshop, Mary Fraker and Anne-Marie Mazza, Rapporteurs; Committee on Science, Technology, and Law; Forum on Drug Discovery: Roundtable on Translating Genomic-Based Research for Health; National Research Council and Institute of Medicine

· Direct-to-consumer genetic testing for health-related purposes in the European Union: the view from EASAC and FEAM

· Hawkins AK, Ho A. Genetic counseling and the ethical issues around direct to consumer genetic testing. Journal of genetic counseling. 2012;21(3):367-73.

· Udesky L. The ethics of direct-to-consumer genetic testing. Lancet. 2010;376(9750):1377-8.